Углеводородокисляющие бактерии и ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия 03. 02. 08. Экология



Скачать 350.12 Kb.
страница1/3
Дата29.04.2016
Размер350.12 Kb.
ТипАвтореферат
  1   2   3
На правах рукописи

СОКОЛОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА

Углеводородокисляющие бактерии и ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия
03.02.08. – Экология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Астрахань – 2012
Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории

микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «Астраханский

Государственный Технический Университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Дзержинская Ирина Станиславовна


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Филенко Олег Федорович

доктор биологических наук, профессор



Курочкина Татьяна Федоровна

Ведущая организация: Институт биологии Уфимского Научного

Центра РАН (г. Уфа)


Защита состоится 11 апреля 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета_Д.307.001.05 при Астраханском Государственном Техническом Университете по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Астраханского Государственного Технического Университета по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16.

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент Э.И. Мелякина


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ассимиляционный потенциал экосистемы моря - это лимитированная способность нейтрализовать и обезвреживать в определенных пределах вредные выбросы, поступающие в морскую среду в результате хозяйственной деятельности (Гусев, 2002; Экономические проблемы…, 1985). Морская среда может выдерживать определенную степень загрязнения - поглощать их, ассимилировать без ущерба для экологической системы (Экономические проблемы…, 1985). При избытке загрязняющих веществ, естественные процессы самоочищения могут не справляться с нагрузкой, что приводит к нарушению функционирования морских сообществ, вплоть до их гибели (Миронов, 2002). При современном антропогенном воздействии на водоемы особую значимость приобретает процесс самоочищения водоемов от загрязняющих веществ, таких как нефтяные углеводороды.

Нефть и нефтепродукты являются одним из крупномасштабных загрязнителей гидросферы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в десятки миллионов тонн. Однако нефтяные углеводороды являются неотъемлемым природным компонентом морской среды и в процессе эволюции выработался довольно эффективный механизм их деструкции.

Самоочищение морских акваторий, загрязненных нефтяными углеводородами, представляет собой комплексный процесс, протекающий под действием физических, химических и биологических факторов, где трансформация нефти и нефтепродуктов гетеротрофным пикопланктоном является ведущим процессом (Миронов, 1973; Morgan, 1989; Leahy, 1990; Коронелли, 1993; Ильинский, 2000; Немировская, 2000; Куликова, 2008 Ильинский, 1979; Израэль, 1989; Миронов, 2002; Рубцова, 2004). Мощная, разнообразная и подвижная ферментативная система, позволяющая переключаться на потребление с одних на другие источники углерода и энергии, высокая пластичность обменных процессов, быстрая адаптация к изменяющимся условиям делают гетеротрофный пикопланктон, особенно его углеводородокисляющую часть, активными участниками процессов самоочищения водоемов от нефтяных углеводородов (Ильинский, 1979; Миронов, 2002; Куликова, 2004).

Особую опасность представляет нефтяное загрязнение в замкнутых водоемах, например, таких как Каспийское море, где началась промышленная добыча углеводородного сырья. На загрязнение экосистемы Северного Каспия влияет не только разведка, добыча и транспортировка нефти и нефтепродуктов, но и речной сток, выносящий такого рода загрязнения в море.

При нефтяном загрязнении морских акваторий наиболее опасным является перемещение нефтяного пятна к прибрежной зоне. Нефтяные разливы негативно влияют на прибрежное растительное сообщество, вызывая гибель растений. Также в микроценозе антропогенно нарушенных почв повышается общая численность грибов-токсинообразователей, среди которых преобладают грибы патогенные для растений, животных и человека.

В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования, посвященные изучению оценки ассимиляционного потенциала воды Северного Каспия от нефтяных углеводородов и роли в этом процессе представителей углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона.



Цель исследования. Исследовать углеводородокисляющие бактерии и создаваемый ими ассимиляционный потенциал морской воды.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить численность углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона в районе лицензионных участков нефтяных компаний ООО «Лукойл» и ООО «Каспийская нефтяная компания»;

2. Оценить потенциальную окислительную способность микроценоза и ассимиляционный потенциал морской воды по величине микробной деградации;

3. Выделить и изучить углеводородокисляющие бактерии гетеротрофного пикопланктона;

4. Определить токсичность активных нефтедеструкторов по биотестированию суспензий бактериальных штаммов и очищенной от нефти морской воды в микроэкосистемах;

5. Исследовать фунгицидную активность и фитотоксичность нефтедеструкторов;

6. Идентифицировать активный штамм-нефтедеструктор с хозяйственно-полезными свойствами.



Научная новизна работы. Впервые проведена оценка ассимиляционного потенциала и потенциальной окислительной способности морской воды на фоновой территории в районе лицензионных участков нефтяных компаний ООО «Лукойл» и ООО «Каспийская нефтяная компания». Выделен и изучен новый штамм Serratia grimesii, способный к деструкции нефтяных углеводородов, нетоксичный по отношению к гидробионтам, обладающий фунгицидной и фитостимулирующей активностями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Присутствие углеводородокисляющих микроорганизмов в пикопланктоне воды Северного Каспия и участие их в процессах самоочищения, которое определяется ассимиляционным потенциалом и потенциальной окислительной способностью морской воды;

2. Выявлен новый микроорганизм с углеводородокисляющими свойствами, который может быть использован для активизации процессов деструкции нефти в морской воде.

Практическая значимость. Расчеты ассимиляционного потенциала по величине микробной деградации нефтяных углеводородов используются ООО «Институт проблем Каспийского моря» для разработки экологически обоснованных норм воздействия ООО «Лукойл» и ООО «Каспийская нефтяная компания» на живую природу. Предложен новый штамм Serratia grimesii, который может быть использован для разработки биопрепарата для ликвидации аварийных разливов нефти в море.

Результаты исследований являлись частью хоздоговорных работ с ООО «Институт проблем Каспийского моря» «Выполнение микробиологических исследований в районе лицензионного участка ООО «Каспийская нефтяная компания» в 2010 г.».



Апробация работы. Результат исследования были представлены на 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009 г), международной научно-практической конференции «Perspektywiczne opracowania sa nauka i tecnhnikami – 2009» (Przemysl, 2009), на всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки» (Уфа, 2010), на международной конференции «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2010), Международной научной конференции «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ- 2010» (Астрахань, 2010), Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010), 1- ой научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа» (Астрахань, 2010), V –ой международной конференции «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2010), Международной конференции с элементами научной школы «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), участие в программе Федерального агентства по делам молодежи «Зворыкинский проект» (Астрахань, 2010), интернет-турнире «Модернизация», проводимый Общероссийской общественной организацией «Деловая Россия» и Интернет-компанией UpSelf (Астрахань, 2010), участие в конкурсе проектов по программе «У.М.Н.И.К.» (Астрахань, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на ____ страницах машинописного текста, иллюстрирована ____ таблицами и ____ рисунками. Список использованной литературы включает ____ источников, из них ____ на иностранных языках.

Автор выражает огромную благодарность и признательность за неоценимую помощь и поддержку научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дзержинской И.С., а также доктору биологических наук, профессору Курапову А.А. и кандидату биологических наук Умербаевой Р.И. за помощь в экспедиционных исследованиях, кандидату биологических наук, доценту Куликовой И.Ю. за консультации при проведении лабораторных исследований, а также всем сотрудникам кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского Государственного Технического Университета.



ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явилась морская вода и гетеротрофный пикопланктон в районе лицензионных участков ООО Лукойл и ООО Каспийская нефтяная компания.

Материалом для написания работы послужили экспедиционные исследования в составе экспедиции ООО «НИИ проблем Каспийского моря» и экспериментальные исследования в лаборатории Микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» в 2008-2010 года. Пробы морской воды отбирались в 3-х зонах (мелководной, свале глубин и приглубой зоне) на 12 станциях в двух горизонтах - поверхностном и придонном (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005). На рисунке 1 представлены исследуемые станции мелководной зоны – 1, 2, 3, 4, свала глубин – 5, 6, 7, 8 и приглубой зоны Северного Каспия – 9, 10, 11, 12. Всего было исследовано 124 пробы.

Рисунок 1 –Схема отбора проб

Гидрохимические анализы воды (определение солености, концентрации нефтепродуктов, рН) проводили согласно общепринятым методам (Константинов, 1986; Другов, 2000). Численность сапротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов определяли методом предельных разведений и проращиванием их на плотных питательных средах: питательном агаре для сапротрофов и среде Миллса с добавлением нефти для углеводородокисляющих (Нетрусов, 2005; Теппрер, 2004; Mills, 1974).

Оценку ассимиляционного потенциала воды (величину бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов или «потоки самоочищения») определяли по формуле:

Б= N*K, (1)

где Б – величина бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов (мг ув*г-1*сут), N – численность нефтеокисляющих бактерий (кл. *г-1), К – количество углеводородов, окисленных одной бактериальной клеткой, рассчитанное ЗоБеллом (3,76*10-8мг*кл -1*сут) (Рубцова, 2003).

Интенсивность минерализации нефтяных остатков определяли по потенциальной способности воды к их окислению (ПОС) по методике Г.Л. Марголиной (Марголина, 1989). Инкубировали в течение 5 суток, при этом ПОС и изменение количественного состава сапротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов производили в начале постановки эксперимента, через 24, 48, 72 и 120 часов (Марголина, 1989; Практикум по микробиологии, 2005; Теппер, 2004).

Для выделения чистых культур микроорганизмов с углеводородокисляющими свойствами использовали метод накопительных микробных культур (Методы почвенной микробиологии …, 1991; Практикум по микробиологии, 2005). Для этого пробы воды, отобранные из вод исследуемого участка Северного Каспия, вносили в колбы с жидкими минеральными средами М9, МКД, среда Чапека, среда Миллса (Mills et al., 1978; Тумайкина, 2007; Павлова, 2008; Дзержинская, 2008), в которые добавляли нефть, дизельное топливо и керосин как единственный источник углерода и энергии. Культивирование проводили при температуре 25 – 28 С для мезофильных и при 6 – 8 С для психроактивных микроорганизмов на качалке при 190 об/мин. в течение 14 суток.

Для выделения микроорганизмов, способных развиваться в присутствии нефти и нефтепродуктов, из каждой накопительной культуры, в которой отмечены признаки готовности, производили глубинный высев методом предельных разведений (102-103) на плотные среды того же состава с вышеуказанными нефтепродуктами. Из выросших колоний выделяли чистые культуры. Для хранения культур использовали те же минеральные среды с нефтью или нефтепродуктами. Чистоту выделенных культур определяли путем рассева на питательный агар и среды с нефтепродуктами и микроскопированием (Егоров, 1995; Практикум по микробиологии, 2005).

Первичный скрининг бактериальных штаммов производили на основе изучения их способности усваивать жидкие нелетучие углеводороды методом лунок по Егорову (Руководство к практическим занятиям, 1983).

Определение культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств культур проводили по общепринятым методикам (Руководство к практическим занятиям, 1983; Егоров, 1995; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005). Предварительную идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя «Определитель бактерий Берджи» и др. (Краткий определитель бактерий Берджи, 1980; Скворова, 1981; Скворцова, 1983; Нестеренко, 1985; Рубан, 1986; Смирнов, 1990; Определитель бактерий Берджи, 1997; Логинов, 2005).

При изучении литических свойств бактериальных штаммов отмечали липолитическую, амилолитическую и протеолитическую активности (Егоров, 1995; Практикум по микробиологии, 2005). Эмульгирующую активность выделенных штаммов определяли методом Купера (Cooper, 1987).

Гидрофилизирующую активность определяли двумя методами:

1) визуальное определение гидрофобных свойств определяли по отталкиванию поверхностями, смоченными бактериальными фильтратами, гидрофобных жидкостей (нефть, масляная краска, подсолнечное масло, окрашенное суданом). Стеклянные, керамические, алюминиевые, стальные, пластиковые и медные палочки погружали на несколько секунд в бактериальные фильтраты, затем в гидрофобные жидкости и визуально определяли степень загрязненности поверхностей гидрофобными жидкостями (пат. № Ru 2112033).

2) количественное определение гидрофобности поверхности клеток осуществляли методом разработанным Розенбергом в модификации Серебряковой. (Серебрякова, 2002).

Деструктивную активность штаммов по отношению к сырой нефти и моторному маслу изучали на стерильной морской воде. Стерильную нефть и моторное масло вносили в количестве 1% по отношению к объему стерильной морской воды, суспензии исследуемых штаммов вносили по 2% по объему. Титр клеток составлял 106 - 107 кл/мл. Содержание нефтепродуктов в эксперименте определяли гравиметрическим методом после 15 суток экспозиции, в качестве элюента использовали хлороформ. Убыль углеводородов определяли по отношению к контролю без внесения штаммов, который имитировал убыль нефтяных фракций за счет физико-химических процессов (Другов, 2000, Белоусова, 2002).

Для выявления способности штаммов разлагать парафин использовали агаризованную среду Маккланга с внесением стерильного расплавленного парафина. Для этого суспензию чистых культур бактерий наносили на поверхность среды, инкубировали при 37 С в течение 14 суток (Теппер, 2004).

Биотестирование суспензий активных штаммов-нефтедеструкторов и морской воды, очищенной от нефти с помощью штаммов-нефтедеструкторов изучали на солоноватоводных рачках Artemia solina и водорослях Scenedesmus quadricauda (Тurp) Breb. При биотестировании на ракообразных Artemia solina оценивали токсичность по гибели науплиусов. Для исследования токсичности на водорослях устанавливали различия между интенсивностью роста водорослей в опыте и культуральной среде (контроль).

Пробы воды из микроэкосистем для исследования отбирались в момент постановки микроэкосистем, через 5, 15 и 30 суток экспозиции. Тестирование проводилось в наборе разведений 1, 10, 50, 100 %-ной концентрации. Определение токсичности исследуемых проб осуществлялось по общепринятым методикам биотестирования (Михеев, 2001; СанПиН 2.1.7.573-96; Приказ МПР РФ от 15 июня 2001 г № 511; Шадрина, 2009).

При попадании нефти на прибрежные территории в почве происходит изменение микроценоза: снижается общая численность микроорганизмов, в то же время численность некоторых физиологических групп, например, углеводородокисляющих микроорганизмов, напротив, – увеличивается, также увеличивается общая численность грибов-токсинообразователей (Марфенина, 1999; Пархоменко, 2008). Активное развитие таких микромицетов негативно влияет на развитие прибрежной растительности (Марфенина, 1999). Поэтому для уменьшения численности и ослабления активности таких грибов при ремедиации нефтезагрязненных территорий рекомендовано использовать микроорганизмы с фунгицидными свойствами. Фунгицидные свойства наиболее активных штаммов-нефтедеструкторов исследовались с помощью модификации метода диффузии в агар с использованием лунок (Моисейченко, 1996).

Фитотоксичность и фитостимулирующую активность штаммов-нефтедеструкторов определяли с помощью эксперимента на прорастание семян кресс-салата сорта «Весенний» (Ганнибал, 2007; Методы экспериментальной микологии, 1982). При определении филогенетического положения наиболее активного штамма-нефтедеструктора проводился анализ последовательности (сиквенсов) 16S-рибосомного гена. Анализ был выполнен в ФГУП «ГосНИИГенетика».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния гетеротрофного пикопланктона на самоочищающую способность воды на фоновой территории в районе лицензионных участков нефтяных компаний ООО «Лукойл» и ОАО «Каспийская нефтяная компания» включали гидрохимические анализы воды. Установлено, что содержание нефтепродуктов по всему исследуемому участку составляет от 0,005 до 0,068 г/л. На большей части станций не отмечено превышения ПДК, кроме 3-х станций: ст. 5 в летний период в поверхностном горизонте свала глубин, где концентрация нефтепродуктов составляет 0,057 г/л, то есть превышение ПДК на 0,007 г/л, ст. 10 и ст. 12 в летний период поверхностного горизонта в приглубой зоне концентрация нефтепродуктов составляет 0,052 и 0,068, то есть отмечено превышение ПДК на 0,002 и 0,018 г/л, соответственно.

Таким образом, для исследуемого участка Северного Каспия не отмечено повышенного нефтяного загрязнения.

Оценка ассимиляционного потенциала морской воды Северной части Каспийского моря

При изучении сапротрофной и углеводородокисляющей части гетеротрофного пикопланктона Северного Каспия установлено, что на численность сапротрофов оказывало влияние изменение температуры и глубины исследуемой акватории. Общая численность сапротрофов в исследуемый период колебалась в пределах от 11,5 тыс. до 50 тыс. кл/мл (табл. 1). Снижение температуры воды (с 25,4-30,3 С летом до 9,8-17,4 С зимой и осенью) вызывает снижение численности сапротрофов в 2 и более раз. Увеличение глубины (от поверхностного горизонта к придонному и с мелководных станций к приглубым) также вызывает снижение численности сапротрофов.

Углеводородокисляющие микроорганизмы присутствовали во всех исследуемых пробах воды. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов колебалась 12,5 тыс. до 24,5 тыс. кл/мл (табл. 1). Для углеводородокисляющих микроорганизмов четкой зависимости численности от глубины не отмечено. Понижение температуры воды до 11,4-17,4 С (осенний период) вызывает снижение численности углеводородокисляющих микроорганизмов на 18-38%, а дальнейшее понижение температуры до 9,8-13,9 С (зимний период) не влияет на численность данной группы микроорганизмов. Полученные данные свидетельствуют о том, что углеводородокисляющие микроорганизмы являются постоянными компонентами микроценоза воды и составляют 4,4 – 11,4 % от численности сапротрофов.

Установлено, что с понижением температуры воды процент углеводородокисляющих микроорганизмов от сапротрофных возрастает.

Таблица 1 – Численность сапротрофных и углеводородустойчивых микроорганизмов в составе пикопланктона на исследуемом участке Северного Каспия (КОЕ/мл * 102)

Зона исследования



Температура воды, С

Сапротрофы, КОЕ/мл*103

Углеводородокисляющие

микроорганизмы



КОЕ/мл*102

% от сапротрофов

Горизонт

Поверхностный

Придонный

Поверхностный

Придонный

Поверхностный

Придонный

Поверхностный

Придонный

Лето

Мелководная

30,3

29,4

50,82,2

48,02,3

24,11,2

24,50,6

4,7

5,1

Свал глубин

29,1

27,9

48,62,6

44,33,6

22,70,4

20,41,4

4,7

4,6

Приглубая

29,1

25,4

44,21,4

43,41,8

21,11,6

19,00,8

4,8

4,4

Осень

Мелководная

11,4

11,5

23,21,3

19,80,9

18,00,6

16,80,5

7,8

8,5

Свал глубин

14,1

14,2

22,50,9

16,71,0

17,50,9

12,50,1

7,8

7,5

Приглубая

17,4

17,4

19,11,2

17,30,4

16,50,8

14,20,3

8,6

8,2

Зима

Мелководная

9,8

10,7

20,30,8

14,70,4

19,70,9

16,70,9

9,7

11,4

Свал глубин

11,4

11,4

18,51,3

12,70,7

18,21,7

14,60,7

9,8

11,5

Приглубая

13,6

13,9

17,50,8

11,50,5

15,50,5

13,50,7

8,9

10,9


  1   2   3


База данных защищена авторским правом ©ekollog.ru 2017
обратиться к администрации

войти | регистрация
    Главная страница


загрузить материал